ELISA中文操作指南

2019-02-20
实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)。往预先包被目标物抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的目标物呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度。
样本处理及要求
1. 血清:全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于2000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
2. 血浆:可用EDTA或肝素作为抗凝剂,标本采集后30分钟内于2 - 8℃ 2000g离心30分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融
3. 细胞培养物上清或其它生物标本:2000g离心20分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融。
注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测。
Elisa Biotech生产的各项指标ELISA试剂盒的检测范围适中。经过大量正常标本检验,标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内,因此,实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时,可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。
需要而未提供的试剂和器材
1.        酶标仪(450nm)
2.        高精度加样器及枪头:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.        37℃恒温箱
4.        蒸馏水或去离子水
试剂盒组成
名称
96孔配置
48孔配置
备注
微孔酶标板
12孔×8条
12孔×4条
标准品
0.5mL*6管
0.5mL*6管
样本稀释液
6mL
3mL
检测抗体-HRP
10mL
5mL
20×洗涤缓冲液
25mL
15mL
按说明书稀释
底物A
6mL
3mL
底物B
6mL
3mL
终止液
6mL
3mL
封板膜
2张
2张
说明书
1份
1份
自封袋
1个
1个
注意事项
1.         严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。
2.         洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。
3.         消除板底残留的液体和手指印,否则影响OD值。
4.         底物显色液应呈无色或很浅的颜色,已经变蓝的底物液不能使用。
5.         避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。
6.         在储存和温育时避免强光直接照射。
7.         平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。
8.         任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。
9.         不能使用过期产品。
10. 如果可能传播疾病,所有的样品都应管理好,按照规定的程序处理样品和检测装置
试剂准备
试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。
2洗涤缓冲液的稀释:蒸馏水按1:20稀释,即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。
操作步骤
1. 从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2. 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3. 样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4. 除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5. 弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板4-5次(也可用洗板机洗板)。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7. 每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标,标准品的浓度值为纵坐标,在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线,并得到直线回归方程,将样品的OD值代入方程,计算出样品的浓度。